Divlja Taq DNA polimeraza
Taq DNA polimeraza je termostabilna DNA polimeraza iz Thermus aquaticus YT-1, koja posjeduje aktivnost polimeraze 5′→3′ i aktivnost endonukleaze 5´ režnja.
Komponente
| komponenta | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Taq pufer | 2×1 mL | 2×10 mL | 2×50 ml | 5×200 ml |
| Taq DNA polimeraza (5 U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 5 mL | 5×10 mL |
Uvjet skladištenja
Prijevoz ispod 0°C i skladištenje na -25°C~-15°C.
Definicija jedinice
Jedna jedinica definirana je kao količina enzima koja inkorporira 15 nmol dNTP-a u materijal netopljiv u kiselini u 30 minuta na 75°C.
Kontrola kvalitete
1.Test čistoće proteina (SDS-PAGE):Čistoća Taq DNA polimeraze je ≥95% određena SDS-PAGE analizom.
2.Endonukleazna aktivnost:Najmanje 5 U Taq DNA polimeraze s 1 μg λDNA tijekom 16 sati na 37 ℃ ne rezultira vidljivom razgradnjom kako je utvrđeno.
3.Aktivnost egzonukleaze:Najmanje 5 U Taq DNA polimeraze s 1 μg λ -Hind Ⅲ digestirane DNA tijekom 16 sati na 37 ℃ ne rezultira vidljivom razgradnjom kako je utvrđeno.
4.Nickase aktivnost:Najmanje 5 U Taq DNA polimeraze s 1 μg pBR322 DNA tijekom 16 sati na 37°C ne rezultira vidljivom razgradnjom kako je utvrđeno.
5.Aktivnost RNaze:Najmanje 5 U Taq DNA polimeraze s 1,6 μg MS2 RNA tijekom 16 sati na 37°C ne rezultira vidljivom razgradnjom kako je utvrđeno.
6.E coliDNK:5 U Taq DNA polimeraze pregledava se na prisutnost genomske DNA E. coli pomoću TaqMan qPCR s početnicama specifičnim za lokus 16S rRNA E. coli.Kontaminacija genomske DNA E. coli je ≤1 kopija.
7.PCR amplifikacija (5,0 kb Lambda DNA)- Reakcija od 50 µL koja sadrži 5 ng Lambda DNA s 5 jedinica Taq DNA polimeraze za 25 ciklusa PCR amplifikacije rezultira očekivanim proizvodom od 5,0 kb.
Postavljanje reakcije
| Komponente | Volumen |
| Predložak DNKa | neobavezan |
| 10 μM Forward Primer | 1 μL |
| 10 μM reverzni primer | 1 μL |
| dNTP mješavina (10 mM svaki) | 1 μL |
| 10×Taq međuspremnik | 5 μL |
| Taq DNA polimerazab | 0,25 μL |
| Voda bez nukleaza | Do 50 μL |
Bilješke:
1) Optimalna reakcijska koncentracija različitih šablona je različita.Sljedeća tablica prikazuje preporučenu upotrebu predloška za reakcijski sustav od 50 µL.
| DNK | Iznos |
| Genomski | 1 ng-1 μg |
| Plazmid ili virus | 1 str.-1 ng |
2) Optimalna koncentracija Taq DNA polimeraze može se kretati od 0,25 µL~1 µL u specijaliziranim primjenama.
ReakcijaProgram
| Korak | Temperatura(°C) | Vrijeme | Ciklusi |
| Početna denaturacijaa | 95 ℃ | 5 minuta | - |
| Denaturacija | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 ciklusa |
| Žarenjeb | 60 ℃ | 15 s | |
| Proširenje | 72 ℃ | 1kb/min | |
| Završni nastavak | 72 ℃ | 5 minuta | - |
Bilješke:
1) Početni uvjet denaturacije prikladan je za većinu reakcija pojačanja i može se modificirati prema složenosti strukture predloška.Ako je struktura predloška složena, vrijeme preddenaturacije može se produžiti na 5 – 10 minuta kako bi se poboljšao početni učinak denaturacije.
2) Temperaturu žarenja potrebno je prilagoditi prema Tm vrijednosti primera, koja je općenito postavljena na 3~5 ℃ niže od Tm vrijednosti primera;Za složene predloške potrebno je prilagoditi temperaturu žarenja i produžiti vrijeme produljenja kako bi se postiglo učinkovito pojačanje.
