Proteinaza K NGS (prah)

Specifikacija

Svojstva

Definicija jedinice

Jedna jedinica NGS proteaze K definirana je kao količina enzima potrebna za hidrolizaciju kazeina u 1 μmol L-tirozina pod standardnim uvjetima određivanja.

 Priprema reagensa

Reagens I:

Supstrat: 1% kazeina iz otopine goveđeg mlijeka: otopite 1 g kazeina goveđeg mlijeka u 50 ml 0,1 M otopine natrijevog fosfata, pH 8,0, zagrijavajte u vodenoj kupelji na 65-70 °C 15 minuta, promiješajte i otopite, ohladite vodom, prilagođenom natrijevog hidroksida do pH 8,0 i razrijedite u 100 ml.

Reagens II:

Otopina TCA: 0,1 M trikloroctene kiseline, 0,2 M natrijevog acetata i 0,3 M octene kiseline (odvažite 1,64 g trikloroctene kiseline + 1,64 g natrijevog acetata + 1,724 mL octene kiseline uzastopno, dodajte 50 mL deionizirane vode, namjestite s HCl na pH 4,03 i razrijedite u 100 ml).

Reagens III:

0,4 m otopina natrijevog karbonata (odvažite 4,24 g bezvodnog natrijevog karbonata i otopite u 100 ml vode)

Reagens IV:

Folin fenol reagens: razrijediti 5 puta s deioniziranom vodom.

Reagens V:

Enzimski razrjeđivač: 0,1 M otopina natrijeva fosfata, pH 8,0.

Reagens VI:

Standardna otopina L-tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozina otopljenog u 0,2 M HCl.

Postupak

1. Uključite UV-Vis spektrofotometar i odaberite fotometrijsko mjerenje.

2. Postavite valnu duljinu na 660 nm.

3. Uključite vodenu kupelj, namjestite temperaturu na 37 ℃, pazite da se temperatura ne mijenja 3-5 minuta.

4. Zagrijte 0,5 mL supstrata u epruveti za centrifugiranje od 2 mL na vodenoj kupelji od 37 ℃ 10 minuta.

5. Ekstrahirajte 0,5 mL razrijeđene otopine enzima u prethodno zagrijanu epruvetu centrifuge 10 minuta.Postavite enzimski razrjeđivač kao praznu skupinu.

6. Dodajte 1,0 mL TCA reagensa odmah nakon reakcije.Dobro promiješajte i inkubirajte u vodenoj kupelji 30 minuta.