EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ovaj pribor je prikladan za ekstrakciju iz 150 – 300 ml bakterijske otopine uzgojene preko noći, korištenjem poboljšane metode SDS-alkalne lize za lizu bakterija.Sirovi ekstrakt se selektivno kombinira s jedinstvenim čistačem endotoksina i odvaja centrifugiranjem kako bi se uklonili endotoksini.Zatim se membrana silika gela selektivno veže na plazmidnu DNA u otopini u uvjetima visokog udjela soli i niskog pH.Nakon toga slijedi dodavanje pufera za pranje kako bi se uklonile nečistoće i druge bakterijske komponente.Na kraju, pufer za eluiranje s niskim udjelom soli i visokim pH koristi se za eluiranje čiste plazmidne DNA s membrane silicijskog matriksa.Membrana silika gela koristi posebnu adsorpcijsku membranu, a razlika u količini adsorpcije između kolone i kolone je vrlo mala, a ponovljivost je dobra.Fenol, kloroform i drugi toksični reagensi nisu potrebni, kao ni koraci taloženja etanolom.Ovaj pribor se može koristiti za brzu ekstrakciju 0,2 -1,5 mg čiste visokokopirane plazmidne DNA, sa stopom ekstrakcije od 80% -90%.Komplet koristi jedinstvenu formulu procesa uklanjanja endotoksina, sadržaj endotoksina je izuzetno nizak, a učinak transfekcije stanica izvrstan.Ekstrahirani plazmid mogao bi se izravno koristiti u probavi enzima, PCR-u, in vitro transkripciji, transformaciji, sekvencioniranju i drugim eksperimentima molekularne biologije.
Uvjeti skladištenja
RNazu A treba skladištiti na -30 ~ -15 ℃ i transportirati na ≤0 ℃.
Čistač endotoksina može se pohraniti na 2 ~ 8 ℃ mjesec dana, pohraniti na -30 ~ -15 ℃ za dugotrajno skladištenjei transportiran na ≤0℃.
Ostale komponente treba čuvati na sobnoj temperaturi (15 ~25 ℃) i transportirati na sobnoj temperaturi.
Komponente
| Komponente | 10RXNS |
| RNaza A | 750 μL |
| Međuspremnik P1 | 75 ml |
| Međuspremnik P2 | 75 ml |
| Međuspremnik P4 | 75 ml |
| Čistač endotoksina | 25 ml |
| Međuspremnik PW | 2 × 22 ml |
| Međuspremnik TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi kolone (Svaka u epruveti za prikupljanje od 50 ml) | 10 |
| Epruveta za sakupljanje bez endotoksina | 2 × 5 |
RNAseA:10 mg/ml, koristi se za uklanjanje RNA.
Međuspremnik P1:pufer za bakterijsku suspenziju, dodajte RNazu A u pufer P1 prije prve uporabe.
Međuspremnik P2:pufer za lizu bakterija (koji sadrži SDS/NaOH).
Međuspremnik P4:neutralizirajući pufer.
Čistač endotoksina:učinkovito uklanja endotoksin iz sirovog ekstrakta plazmida.
Međuspremnik PW:pufer za ispiranje, dodajte propisani volumen etanola prije prve uporabe.
Međuspremnik TB:elucijski pufer.
FastPure DNA Maxi stupci:plazmidne DNA adsorpcijske kolone.
Tube za sakupljanje 50 ml:cijevi za sakupljanje filtrata.
Epruveta za sakupljanje bez endotoksina:epruvete za sakupljanje plazmidne DNA.
Pripremljeni materijali
Apsolutni etanol, izopropanol, epruvete za centrifugiranje s okruglim dnom od 50 ml i 50 ml bez endotoksinacentrifugalne cijevi.
Prijave
Ovaj proizvod je prikladan za veliku ekstrakciju plazmida iz 150 - 300 ml bakterijske otopineuzgojeno preko noći.
Eksperimentalni proces
1. Uzmite 150 – 200 ml (ne više od 300 ml) bakterijske otopine uzgojene preko noći i centrifugirajte naoko 11.000 okretaja u minuti (12.000 × g) 1 – 2 min.Bacite supernatant i sakupite bakterije.
Δ Kada se sakupi više od 50 ml bakterijske otopine, bakterije se mogu sakupiti dodavanjem bakterijske otopine, centrifugiranjem, odbacivanjem supernatanta i drugim koracima u istoj epruveti od 50 ml za
više puta.
2. Dodajte 7,5 ml pufera P1 (provjerite je li RNaza A dodana u pufer P1) u centrifuguepruvetu koja sadrži bakterije i temeljito promiješajte vorteksom ili pipetom.
Δ Potpuna resuspenzija bakterija u ovom koraku ključna je za prinos, a nakon resuspendiranja ne bi trebalo biti nakupina bakterija.Ako postoje bakterijske nakupine koje nisu temeljito izmiješane, to će utjecati na lizu, što će rezultirati niskim prinosom i čistoćom.Ako je OD600 bakterijske otopine 0,65, preporučuje se korištenje 7,5 ml pufera P1 pri ekstrakciji iz 150 ml bakterijske otopine;kada je OD600 0,75, treba upotrijebiti 8 ml pufera P1 i volumene pufera P2 i P4 treba promijeniti u skladu s tim.Ako se volumen bakterijske otopine poveća na 200 ml, preporuča se da sevolumen pufera P1, P2 i P4 treba proporcionalno povećati.
3. Dodajte 7,5 ml pufera P2 bakterijskoj suspenziji iz koraka 2 i lagano miješajte gore-dolje 6 – 8puta i inkubirati na sobnoj temperaturi 4 – 5 min.
Δ Lagano preokrenite kako biste temeljito promiješali.Vrtložno miješanje uzrokovat će fragmentaciju genomske DNA, što će rezultirati fragmentima genomske DNA u ekstrahiranom plazmidu.U to vrijeme otopina postaje viskozna i prozirna, što pokazuje da su bakterije potpuno lizirane.Trajanje ne smije biti dulje od 5 minuta kako bi se izbjeglo uništavanje plazmida.Ako otopina nije bistra, može doći do previše bakterijanepotpuna liza, pa količinu bakterija treba odgovarajuće smanjiti.
4. Dodajte 7,5 ml pufera P4 bakterijskoj suspenziji iz koraka 3 i odmah lagano preokrenite 6 – 8 puta kako bi otopina potpuno neutralizirala pufer P2.U to vrijeme trebao bi se pojaviti bijeli pahuljasti talog.Centrifugirajte na više od oko 11 000 okretaja u minuti (12 000 × g) 10 – 15 minuta, pažljivo pipetirajte supernatant u novu epruvetu centrifuge s okruglim dnom od 50 ml (koju ste sami pripremili) i izbjegavajteaspirirajte plutajući bijeli talog.
Δ Dodajte pufer P4 i odmah preokrenite da se dobro promiješa.Ostavite epruvetu da stoji dok se bijeli talog ravnomjerno ne rasporedi po cijeloj otopini kako bi se spriječilo stvaranje lokalnih taloga koji bi mogli utjecati na neutralizaciju.Ako prije centrifugiranja nema ravnomjernog bijelog pahuljastog taloga i supernatant nije bistar nakon centrifugiranja, epruveta se možecentrifugirano još 5 min.
5. Dodajte 0,1 puta veći volumen (10% volumena supernatanta, oko 2,2 ml) Endotoksin Scavengera u supernatant iz koraka 4 i preokrenite da se promiješa.Otopinu stavite u ledenu kupelj ili ubacite u zdrobljeni led (ili zamrzivač hladnjaka) na 5 minuta dok se otopina ne promijeni iz mutne u bistru i prozirnu (ili još uvijekmalo zamućen), te povremeno nekoliko puta promiješati.
Δ Nakon što se čistač endotoksina doda supernatantu, supernatant će postati mutan, alisupernatant bi trebao postati bistar (ili blago zamućen) nakon hlađenja u ledenoj kupelji.
6. Nakon što se supernatant stavi na sobnu temperaturu (>25 ℃) 10 – 15 minuta, postat će mutan jernjegova se temperatura povećava do sobne temperature.Zatim se supernatant treba preokrenuti da se miješa.
Δ Ako je sobna temperatura niža ili želite skratiti vrijeme ekstrakcije, supernatant se može inkubirati u vodenoj kupelji od 37 ~ 42 ℃ 5 – 10 minuta, a sljedeći korak može se izvesti nakon supernatantapostaje mutna.
7. Centrifugirajte supernatant na oko 11 000 okretaja u minuti (12 000 × g) 10 minuta na sobnoj temperaturi (temperatura mora biti >25 ℃) kako biste odvojili fazu.Gornja vodena faza sadrži DNA dok donji plavi sloj uljaste faze sadrži endotoksin i druge nečistoće.Prijenosvodenu fazu koja sadrži DNA u novu epruvetu iodbacite masni sloj.
Δ Temperatura tijekom centrifugiranja mora biti iznad 25 ℃ jer učinkovito odvajanje faza nijepojaviti ako je temperatura preniska.
Δ Ako odvajanje faza nije učinkovito, temperatura centrifugiranja može se podesiti na 30 ℃ ivrijeme centrifugiranja može se povećati na 15 min.
Δ Ne usisavajte plavi masni sloj jer sadrži endotoksin i druge nečistoće.
Mehanizam
Resuspenzijska liza Neutralizacija
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P1
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P2
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P4
Uklanjanje endotoksina
◇Dodajte 0,1 puta veći volumen supernatanta sredstva za čišćenje endotoksina
Uvezivanje i pranje
◇ Dodajte 0,5 puta veći volumen izopropanola
◇ Dodajte 10 ml pufera PW
◇ Dodajte 10 ml pufera PW
Eluiranje
◇ Dodajte 1 – 2 ml pufera TB ili ddH2O bez endotoksina
