Inhibitor Rnaze
Inhibitor mišje RNaze je rekombinantni inhibitor mišje RNaze eksprimiran i pročišćen iz E.coli.Veže se na RNazu A, B ili C u omjeru 1:1 putem nekovalentne veze, čime inhibira aktivnost triju enzima i štiti RNA od razgradnje.Međutim, nije učinkovit protiv RNaze 1, RNaze T1, S1 nukleaze, RNaze H ili RNaze iz Aspergillus.Inhibitor mišje RNaze testiran je pomoću RT-PCR, RT-qPCR i IVT mRNA, te je bio kompatibilan s raznim komercijalnim reverznim transkriptazama, DNA polimerazama i RNA polimerazama.
U usporedbi s ljudskim inhibitorima RNaze, inhibitor mišje RNaze ne sadrži dva cisteina koji su vrlo osjetljivi na oksidaciju koja uzrokuje inaktivaciju inhibitora.To ga čini stabilnim pri niskim koncentracijama DTT (manje od 1 mM).Ova značajka ga čini prikladnim za upotrebu u reakcijama gdje su visoke koncentracije DTT nepovoljne za reakciju (npr. RT-PCR u stvarnom vremenu).
Aprimjena
Ovaj se proizvod može naširoko koristiti u bilo kojem eksperimentu gdje je moguća interferencija RNaze kako bi se izbjegla degradacija RNK, kao što su:
1.Sinteza prvog lanca cDNA, RT-PCR, RT-qPCR itd.
2.Štiti RNA od razgradnje tijekom in vitro transkripcije/translacije (npr. in vitro virusni replikacijski sustav).
3.Inhibicija aktivnosti RNAze tijekom odvajanja i pročišćavanja RNA.
Uvjeti skladištenja
Proizvod se može čuvati na -25～- 15 ℃, vrijedi 2 godine.
Međuspremnik za pohranu
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT i 50% glicerol.
Definicija jedinice
Količina inhibitora mišje RNaze potrebna za inhibiciju aktivnosti 5 ng ribonukleaze A za 50% definirana je kao jedna jedinica (U).
Molekularna težina proteina
Molekulska težina inhibitora mišje RNaze je 50 kDa.
Kontrola kvalitete
egzonukleaza Aktivnost:
40 U inhibitora mišje RNaze s 1 μg λ -Hind III digestirane DNA na 37 ℃ tijekom 16 sati ne daje razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Aktivnost endonukleaze:
40 U inhibitora mišje RNaze s 1 μ g λ DNA na 37 ℃ tijekom 16 sati ne daje razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Rezanje Aktivnost:
40U inhibitora mišje RNaze s 1 μ g pBR322 na 37 ℃ tijekom 16 sati ne dovodi do razgradnje što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
RNaza Aktivnost:
40U inhibitora mišje RNaze s 1,6 μg MS2 RNA tijekom 4 sata na 37 ℃ ne izaziva razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
E.coli DNK:
40 U mišjeg inhibitora RNaze pregledano je na prisutnost genomske DNA E. coli pomoću TaqMan qPCR s početnicama specifičnim za lokus 16S rRNA E. coli.Kontaminacija genomske DNA E. coli je ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1. Snažno osciliranje ili miješanje dovest će do inaktivacije enzima.
2. Optimalni temperaturni raspon ovog inhibitora bio je 25-55 ℃, a bio je inaktiviran na 65 ℃ i više.
3. Aktivnosti RNaze H, RNaze 1 i RNaze T1 nisu inhibirane mišjim inhibitorom RNaze.
4. Inhibicija aktivnosti RNaze nađena je u širokom rasponu pH (pH 5-9 svi su bili aktivni), a najveća aktivnost uočena je pri pH 7-8.
5. Budući da ribonukleaze obično zadržavaju aktivnost u uvjetima denaturacije, mora se paziti da se izbjegne denaturacija molekula inhibitora RNaze koje su se kompleksirale s ribonukleazom.Kako bi se spriječilo otpuštanje aktivne ribonukleaze, treba izbjegavati temperature veće od 50 °C i visoke koncentracije uree ili drugih sredstava za denaturaciju.
