Robustart Taq DNA polimeraza
Robustart Taq DNA polimeraza je DNA polimeraza s vrućim startom.Ovaj proizvod ne samo da može bolje inhibirati nespecifičnu reakciju uzrokovanu nespecifičnim žarenjem početnica ili agregacijom početnica u procesu pripreme i amplifikacije PCR sustava.Stoga ima izvrsnu specifičnost i učinkovitiji je za amplificiranje šablona niske koncentracije, a prikladan je za multipleksiranu PCR reakciju amplifikacije.Štoviše, ovaj proizvod ima vrlo dobru primjenjivost, a stabilni rezultati amplifikacije mogu se dobiti u različitim vrstama PCR reakcija.
Komponente
1.5 U/μL Robustart Taq DNA polimeraza
2.10 × PCR pufer II (bez Mg²+) (izborno)
3.25 mM MgCl2(neobavezno)
* 10 × PCR pufer II (bez Mg²+) ne sadrži dNTP i Mg²+, dodajte dNTP i MgCl2prilikom pripreme reakcijskog sustava.
Preporučene aplikacije
1.Brzo pojačanje.
2.Višestruko pojačanje.
3.Izravna amplifikacija krvi, briseva i drugih uzoraka.
4.Detekcija bolesti dišnog sustava.
Uvjet skladištenja
-20°C za dugotrajno skladištenje, treba dobro promiješati prije upotrebe, izbjegavati često zamrzavanje-otapanje.
*Ako nakon hlađenja dođe do taloženja, to je normalno;preporuča se uravnotežiti na sobnu temperaturu prije miješanja i upotrebe.
Definicija jedinice
Jedna aktivna jedinica (U) definirana je kao količina enzima koja ugrađuje 10 nmol deoksiribonukleotida u materijal netopljiv u kiselini na 74°C tijekom 30 minuta korištenjem aktivirane DNA sperme lososa kao uzorka/primera.
Kontrola kvalitete
1.SDS-PAGE elektroforetska čistoća veća od 98%.
2.Osjetljivost pojačanja, kontrola od serije do serije, stabilnost.
3.Nema aktivnosti egzogene nukleaze, nema egzogene endonukleaze ili kontaminacije egzonukleazom
upute
Postavljanje reakcije
| Komponente | glasnoća (μL) | Konačna koncentracija |
| 10 × PCR pufer II (bez Mg²+)a | 5 | 1× |
| dNTP (10 mM svaki dNTP) | 1 | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 | 1-4 mM |
| Robustart Taq DNA polimeraza (5U/μL) | 0,25-0,5 | 1,25-2,5 U |
| 25 × Mješavina temeljnog premazab | 2 | 1× |
| Predložak | - | ＜ 1 μg/reakcija |
| ddH2O | do 50 | - |
Bilješke:
1) a.Pufer ne sadrži dNTP i Mg²+, dodajte dNTP i MgCl2prilikom pripreme reakcijskog sustava.
2) b.Ako se koristi za qPCR/qRT-PCR, u reakcijski sustav treba dodati fluorescentne sonde.Obično će konačna koncentracija primera od 0,2 μM dati dobre rezultate;ako je učinak reakcije loš, koncentracija primera može se podesiti u rasponu od 0,2-1 μM.Koncentracija sonde obično se optimizira u rasponu od 0,1-0,3 μM.Eksperimenti s gradijentom koncentracije mogu se provesti kako bi se pronašla najbolja kombinacija primera i sonde.
Protokol toplinskog ciklusa
| Redoviti PCRpostupak | |||
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklusi |
| Preddenaturacija | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturacija | 95 ℃ | 10-20 sek | 40-50 (prikaz, stručni). |
| Žarenje/proširenje | 56-64 ℃ | 20-60 sek | |
| Brzi PCRpostupak | |||
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklusi |
| Preddenaturacija | 95 ℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturacija | 95 ℃ | 1-5 sek | 40-45 (prikaz, stručni). |
| Žarenje/proširenje | 56-64 ℃ | 5-20 sek | |
Bilješke
1.Brzina amplifikacije brze DNA polimeraze ne smije biti manja od 1 kb/10 s.Brzina porasta i pada temperature, način kontrole temperature i učinkovitost provođenja topline različitih PCR instrumenata uvelike se razlikuju, stoga se preporučuje optimizacija optimalnih uvjeta reakcije za određeni brzi PCR instrument.
2.Sustav je vrlo prilagodljiv, s većom specifičnošću i osjetljivošću.
3.Prikladni za upotrebu kao visokoosjetljivi reagensi za PCR detekciju i mogu se koristiti u reakcijama višestruke PCR amplifikacije.
4.aktivnost 5′→3′ polimeraze, aktivnost 5′→3′ egzonukleaze;nema aktivnosti egzonukleaze 3′→5′;nema funkcije lekture.
5.Pogodno za kvalitativno i kvantitativno testiranje PCR i RT-PCR.
6.3' kraj PCR produkta je A, koji se može izravno klonirati u T vektor.
7.Metoda u tri koraka preporučuje se za primere s niskim temperaturama žarenja ili za amplificiranje fragmenata dužih od 200 bp.
