Proteinaza K mNGS (tekućina)
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza sa širokom specifičnošću supstrata.Razgrađuje mnoge proteine u prirodnom stanju čak i u prisutnosti deterdženata.Dokazi iz studija kristalne i molekularne strukture pokazuju da enzim pripada obitelji subtilizina s katalitičkom trijadom aktivnog mjesta (Asp39-Njegov69-Ser224).Prevladavajuće mjesto cijepanja je peptidna veza uz karboksilnu skupinu alifatskih i aromatskih aminokiselina s blokiranim alfa amino skupinama.Obično se koristi zbog svoje široke specifičnosti.Ova proteinaza K je posebno dizajnirana za mNGS.U usporedbi s drugom proteinazom K, sadrži još manje kontaminacije nukleinskom kiselinom s istim enzimskim djelovanjem, što bi moglo bolje osigurati daljnju primjenu mNGS-a.
Uvjeti skladištenja
2-8 ℃ 2 godine
Specifikacija
| Izgled | Bezbojna do svijetlosmeđa tekućina |
| Aktivnost | ≥800 U/ml |
| Koncentracija proteina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ništa nije otkriveno |
| DNaza | Ništa nije otkriveno |
| RNaza | Ništa nije otkriveno |
Svojstva
| EC broj | 3.4.21.64(Rekombinant iz Tritirachium albuma) |
| Izoelektrična točka | 7.81 |
| Optimalni pH | 7,0- 12,0 Sl. 1 |
| Optimalna temperatura | 65 ℃ Sl. 2 |
| pH stabilnost | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) sl. 3 |
| Toplinska stabilnost | Ispod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) sl. 4 |
| Stabilnost skladištenja | Preko 90% aktivnosti tijekom 12 mjeseci na 25 ℃ |
| Aktivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | Diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Prijave
1. Komplet za genetsku dijagnostiku
2. Kompleti za ekstrakciju RNA i DNA
3. Ekstrakcija neproteinskih komponenti iz tkiva, razgradnja proteinskih nečistoća, kao što je DNAcjepiva i priprema heparina
4. Priprema kromosomske DNA pulsnom elektroforezom
5. Western blot
6. Enzimski glikozilirani albuminski reagensi in vitro dijagnostika
Mjere predostrožnosti
Nosite zaštitne rukavice i naočale tijekom uporabe ili vaganja i dobro prozračite nakon uporabe.Ovaj proizvod može izazvati alergijsku reakciju na koži i ozbiljnu iritaciju očiju.Ako se udiše, može izazvati simptome alergije ili astme ili dispneju.Može izazvati iritaciju dišnog sustava.
Definicija jedinice
Jedna jedinica (U) definirana je kao količina enzima potrebna za hidrolizu kazeina da bi se proizveo 1 μmoltirozina u minuti pod sljedećim uvjetima.
Priprema reagensa
Reagens I: 1 g mliječnog kazeina otopljeno je u 50 ml 0,1 M otopine natrijevog fosfata (pH 8,0), inkubirano u vodi na 65-70 ℃ 15 minuta, miješano i otopljeno, ohlađeno vodom, podešeno natrijevim hidroksidom na pH 8,0 i fiksiran volumen 100 ml.
Reagens II: 0,1 M trikloroctena kiselina, 0,2 M natrijev acetat, 0,3 M octena kiselina.
Reagens III: 0,4 M Na2CO3riješenje.
Reagens IV: Forint reagens razrijeđen čistom vodom 5 puta.
Reagens V: enzimski razrjeđivač: 0,1 M otopina natrijeva fosfata (pH 8,0).
Reagens VI: otopina tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozina otopljenog s 0,2M HCl.
Postupak
1. 0,5 ml reagensa I prethodno je zagrijano na 37 ℃, dodajte 0,5 ml otopine enzima, dobro promiješajte i inkubirajte na37 ℃ 10 minuta.
2. Dodajte 1 ml reagensa II da zaustavite reakciju, dobro promiješajte i nastavite inkubaciju 30 minuta.
3. Centrifugirajte reakcijsku otopinu.
4. Uzmite 0,5 ml supernatanta, dodajte 2,5 ml reagensa III, 0,5 ml reagensa IV, dobro promiješajte i inkubirajte na 37 ℃za 30 minuta.
5. OD660je određen kao OD1;slijepa kontrolna skupina: 0,5 ml reagensa V koristi se za zamjenu enzimaotopina za određivanje OD660kao OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 mL različite koncentracije otopine L-tirozina, 2,5 mL reagensa III, 0,5 mL reagensa IV u epruveti za centrifugu od 5 mL, inkubirati na 37 ℃ 30 minuta, detektirati OD660za različite koncentracije L-tirozina, tada se dobiva standardna krivulja Y=kX+b, gdje je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Kalkulacija
2: Ukupni volumen reakcijske otopine (mL)
0,5: Volumen otopine enzima (mL)
0,5: Volumen reakcijske tekućine korišten u kromogenom određivanju (mL)
10: Vrijeme reakcije (min)
Df: Višestruko razrjeđivanje
C: Koncentracija enzima (mg/mL)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972.);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komun.(1971.);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975.);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figure
sl.1 Optimalno pH
100 mM puferska otopina: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicin-NaOH. Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 2. Optimalna temperatura
Reakcija u 20 mM K-fosfatnom puferu pH 8,0.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25 ℃, 16 h-tretman s 50 mM otopinom pufera: pH 4,5- 5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Sl.4 Toplinska stabilnost
30 min-tretman s 50 mM Tris-HCl puferom, pH 8,0.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Sl.5 Skladištenje stabilnity at 25 ℃
