Uracil DNA glikozilaza
Uracil-DNA glikozilaza (UNG ili UDG) je rekombinantni klon E.coli molekulske mase 25 kDa.Katalizira otpuštanje slobodnog uracila iz jednolančane i dvolančane DNA koja sadrži uracil i neaktivan je protiv RNA te se može koristiti za sprječavanje kontaminacije proizvoda PCR amplifikacije.Princip djelovanja temelji se na činjenici da ako se dUTP zamijeni dTTP u PCR reakciji i nastane produkt PCR amplifikacije koji sadrži dU baze, enzim može selektivno prekinuti glikozidnu vezu U baza u jednolančanim i dvolančanim DNA i razgraditi produkt PCR amplifikacije.
Preporučena primjena
Sprječavanje kontaminacije pojačanje
Uvjet skladištenja
-20°C za dugotrajno skladištenje, treba dobro promiješati prije upotrebe, izbjegavati često zamrzavanje-otapanje.
Međuspremnik za pohranu
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizator, 50% glicerol.
Definicija jedinice
Količina enzima potrebna za razgradnju 1 µg jednolančane DNA koja sadrži dU baze u 1 satu na 37°C je 1 jedinica.
Kontrola kvalitete
1.SDS-PAGE elektroforetska čistoća veća od 98%
2.Osjetljivost pojačanja, kontrola od serije do serije, stabilnost
3.Nakon što se 1U UNG-a tretira na 50 ℃ tijekom 2 minute, predložak koji sadrži U ispod 103 kopije trebao bi se potpuno razgraditi i ne može se proizvesti proizvod pojačanja
4.Nema aktivnosti egzogene nukleaze
upute
| Komponente | Volumen (μL) | Konačna koncentracija |
| 10 × PCR pufer (bez dNTP, Mg²+besplatno) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zamijeni dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Mješavina temeljnog premazaa | 2 | 1× |
| Predložak | - | <1μg/reakcija |
| ddH₂O | do 50 | - |
Bilješka: a: Ako se koristi za qPCR/qRT-PCR, fluorescentnu sondu treba dodati u reakcijski sustav.Obično konačna koncentracija primera od 0,2 μM može dati dobre rezultate;kada je učinak reakcije loš, koncentracija primera može se podesiti u rasponu od 0,2-1 μM.Obično je koncentracija sonde optimizirana u rasponu od 0,1-0,3 μM.Eksperimenti s gradijentom koncentracije mogu se provesti kako bi se pronašla najbolja kombinacija primera i sonde.
Bilješke
1.Enzim UNG može se koristiti za uklanjanje kontaminiranih dUTP produkata amplifikacije iz reakcijskog sustava prije PCR reakcije amplifikacije, zatim za izbjegavanje lažno pozitivnih rezultata zbog kontaminacije proizvodom.
2.Optimalna temperatura za UNG enzim koji se koristi u PCR reakciji protiv kontaminacije općenito je 50 ℃ tijekom 2 minute;stanje inaktivacije je 95 ℃ tijekom 5 minuta.
3.Izbjegavajte često smrzavanje-otapanje i ne izlažite ga velikim temperaturnim oscilacijama.
4.Različiti geni koje treba amplificirati imaju različitu učinkovitost iskorištavanja dUTP-a i osjetljivost na UNG enzim, stoga, ako uporaba UNG sustava dovodi do smanjenja osjetljivosti detekcije, reakcijski sustav treba prilagoditi i optimizirati, ako trebate tehničku podršku, obratite se naša tvrtka.
