Proteinaza K (tekućina)
Kataloški broj: HC4502A
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza sa širokom specifičnošću supstrata.Razgrađuje mnoge proteine u prirodnom stanju čak i u prisutnosti deterdženata.Dokazi iz studija kristalne i molekularne strukture pokazuju da enzim pripada obitelji subtilizina s katalitičkom trijadom aktivnog mjesta (Asp39-Njegov69- Ser224).Prevladavajuće mjesto cijepanja je peptidna veza uz karboksilnu skupinu alifatskih i aromatskih aminokiselina s blokiranim alfa amino skupinama.Obično se koristi zbog širokespecifičnost.
Specifikacija
| Izgled | Bezbojna do svijetlosmeđa tekućina |
| Aktivnost | ≥800 U/ml |
| Koncentracija proteina | ≥20 mg/ml |
| DNaza | Ništa nije otkriveno |
| RNaza | Ništa nije otkriveno |
Uvjeti skladištenja
Čuvati na temperaturi od 2-8 ℃.
Svojstva
| EC broj | 3.4.21.64 (Rekombinant iz Tritirachium albuma) |
| Molekularna težina | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična točka | 7.81 |
| Optimalni pH | 7,0-12,0 Sl.1 |
| Optimalna temperatura | 65 ℃ Sl.2 |
| pH stabilnost | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Slika 3 |
| Toplinska stabilnost | Ispod 50 ℃ (pH 8,0, 30 minuta) Sl.4 |
| Aktivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | Diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Prijave
1. Komplet za genetsku dijagnostiku
2. Kompleti za ekstrakciju RNA i DNA
3. Ekstrakcija neproteinskih komponenti iz tkiva, razgradnja proteinskih nečistoća, kao što su DNA cjepiva i priprema heparina
4. Priprema kromosomske DNA pulsnom elektroforezom
5. Western blot
6. Enzimski glikozilirani albuminski reagensi in vitro dijagnostika
Mjere predostrožnosti
Nosite zaštitne rukavice i naočale tijekom uporabe ili vaganja i dobro prozračite nakon uporabe.Ovaj proizvod može izazvati alergijsku reakciju na koži i ozbiljnu iritaciju očiju.Ako se udiše, može izazvati simptome alergije ili astme ili dispneju.Može izazvati iritaciju dišnog sustava.
Ispitivanje
Definicija jedinice
Jedna jedinica (U) definirana je kao količina enzima potrebna za hidrolizu kazeina da bi se proizveo 1 μmol tirozina u minuti pod sljedećim uvjetima.
Priprema reagensa
Reagens I: 1 g mliječnog kazeina otopljeno je u 50 ml 0,1 M otopine natrijevog fosfata (pH 8,0), inkubirano u vodi na 65-70 ℃ 15 minuta, miješano i otopljeno, ohlađeno vodom, podešeno natrijevim hidroksidom na pH 8,0 i fiksirano volumen 100 ml.
Reagens II: TCA otopina: 0,1 M trikloroctena kiselina, 0,2 M natrijev acetat, 0,3 M octena kiselina.
Reagens III: 0,4 M Na2CO3riješenje.
Reagens IV: Forint reagens razrijeđen čistom vodom 5 puta.
Reagens V: enzimski razrjeđivač: 0,1 M otopina natrijeva fosfata (pH 8,0).
Reagens VI: Otopina tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozina otopljenog u 0,2 M HCl.
Postupak
1. 0,5 ml reagensa I prethodno je zagrijano na 37 ℃, dodajte 0,5 ml otopine enzima, dobro promiješajte i inkubirajte na 37 ℃ 10 minuta.
2. Dodajte 1 ml reagensa II da zaustavite reakciju, dobro promiješajte i nastavite inkubaciju 30 minuta.
3. Centrifugirajte reakcijsku otopinu.
4. Uzmite 0,5 ml supernatanta, dodajte 2,5 ml reagensa III, 0,5 ml reagensa IV, dobro promiješajte i inkubirajte na 37 ℃ 30 minuta.
5. OD660je određen kao OD1;slijepa kontrolna skupina: 0,5 ml reagensa V koristi se za zamjenu otopine enzima za određivanje OD660kao OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 mL različite koncentracije otopine L-tirozina, 2,5 mL reagensa III, 0,5 mL reagensa IV u epruveti za centrifugu od 5 mL, inkubirati na 37 ℃ 30 minuta, detektirati OD660za različite koncentracije L-tirozina, tada se dobiva standardna krivulja Y=kX+b, gdje je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Kalkulacija
2: Ukupni volumen reakcijske otopine (mL)
0,5: Volumen otopine enzima (mL)
0,5: Volumen reakcijske tekućine korišten u kromogenom određivanju (mL)
10: Vrijeme reakcije (min)
Df: Višestruko razrjeđivanje
C: Koncentracija enzima (mg/mL)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972.);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Komun.(1971.);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975.);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figure
sl. 1 Optimalno pH
100 mM puferska otopina: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicin-NaOH. Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 2. Optimalna temperatura
Reakcija u 20 mM K-fosfatnom puferu pH 8,0.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25 ℃, 16 h-tretman s 50 mM otopinom pufera: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 4 Toplina stabilnost
30 min-tretman s 50 mM Tris-HCl puferom, pH 8,0.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 5 Skladištenje stabilnity at 25 ℃
