Plant direct PCR Kit
Kataloški broj: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit prikladan je za izravno umnožavanje biljnog lišća, sjemena itd. i može se koristiti za visokoučinkoviti skrining biljnih uzoraka koji ne sadrže polisaharide i polifenole.DNA polimeraza izravne amplifikacije temeljena na usmjerenoj evoluciji ima superiornu toleranciju na PCR inhibitore u biljkama.U međuvremenu, održava visoke performanse amplifikacije, što je prikladno za amplificiranje fragmenata DNA unutar 5 kb.Jedinstveni pufer za lizu A u kompletu može se koristiti za lizu svježih ili smrznutih biljnih tkiva.Jednostavan je za rukovanje i lizat se može koristiti kao predložak za pojačavanje bez pročišćavanja.Sustav sadrži zaštitna sredstva koja omogućuju učinkovito pojačavanje sirovih uzoraka nakon opetovanog zamrzavanja i odmrzavanja.2 × Plant Direct Master Mix samo treba dodati primere i predloške za izvođenje reakcije pojačanja, čime se smanjuju operacije pipetiranja i poboljšava propusnost detekcije i ponovljivost rezultata.
Komponente
| Komponente | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Pufer za izravnu lizu biljke A | 5 ml | 20 ml |
| Pufer za izravnu lizu biljaka B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Puffer B je izborni reagens koji se koristi za neutralizaciju Plant Direct Lysis pufera A za produljenje vremena skladištenja uzoraka.Može se koristiti prema stvarnoj situaciji.
Uvjeti skladištenja
2 × Plant Direct Master Mix, čuvajte na -30 ~ -15 ℃ i izbjegavajte ponovno zamrzavanje i odmrzavanje;Pufer za izravnu lizu biljaka, čuvajte na -30 ~ -15 ℃ ili 2 ~ 8 ℃.
Eksperimentalni proces
Obrada uzoraka–List biljke
Izravna metoda:Preporuča se koristiti mlado lišće.Upotrijebite bušilicu s fiksnim promjerom od 0,5 – 3 mm kako biste dobili mali i jednolični uzorak, a zatim izravno dodajte uzorak u PCR sustav (preporučuje se sustav od 50 μl).Napomena, provjerite je li uzorak u PCR otopini, a ne uz stijenku epruvete.Ako se izravni PCR koristi za umnožavanje dugih fragmenata i složenih uzoraka, upotreba uzorka manjeg promjera (0,5 – 1 mm) kao predloška može pomoći u dobivanju boljih rezultata.
Metoda lize mljevenja:Preporuča se koristiti mlado lišće.Uzmite mali komad lista (otprilike 1 – 3 mm u promjeru), stavite ga u 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab i sameljite ga što je više moguće (ovaj korak možete učiniti stiskanjem lista vrhom pipete od 100 μl zgnječiti uzorak) .Ako se koriste veći volumeni lisnog tkiva (ne prelaze 7 mm), povećajte volumen pufera za razrjeđivanje na 50 μl.Nakon što se listovi samelju, otopina bi trebala biti zelena.Nakon kratkog centrifugiranja, dodajte 1 μl supernatanta u PCR sustav kao reakcijski šablonc.
Metoda toplinske lize:Preporuča se koristiti mlado lišće.Uzmite mali komad lista (oko 1 – 3 mm u promjeru), stavite ga u 20 μl pufera A za izravnu lizu biljaka i zagrijavajte na 95°C 5 – 10 minuta.Vrijeme lize može se prikladno produljiti za listove koji se teško liziraju (ne više od 20 min).Ako se koriste veći volumeni lisnog tkiva (ne prelaze 7 mm), povećajte volumen pufera za razrjeđivanje na 50 μl.Nakon zagrijavanja, kratko centrifugirajte i dodajte 1 μl supernatanta u PCR sustav kao reakcijski šablonb.
Obrada uzoraka– Sjeme biljke
Metoda lize mljevenja:Skalpelom izrežite sjemenke promjera 5 mm, dodajte ih u 100 μl pufera A za izravnu lizu biljaka i usitnite uzorak vrhom pipete ili drugim alatom.Promiješajte kratko i ostavite stajati na sobnoj temperaturi 3 – 5 minuta.Provjerite je li uzorak sjemena potopljen u pufer za razrjeđivanje.Nakon kratkog centrifugiranja, dodajte 1 μl supernatanta u PCR sustav kao reakcijski šablon.
Metoda toplinske lize:Skalpelom izrežite sjemenke promjera 5 mm, dodajte ih u 100 μl Plant Direct Lysis puffer A i zagrijavajte na 95°C 5 – 10 min.Vrijeme lize može se prikladno produžiti za listove koji se teško liziraju (ne više od 30 min).Nakon zagrijavanja, kratko centrifugirajte i dodajte 1 μl supernatanta u PCR sustav kao reakcijski šablonb.
a.Škare ili drugi alati također se mogu koristiti za rezanje uzoraka odgovarajuće veličine;ako se bušilica ili škare ponovno koriste, treba ih očistiti 2% otopinom natrijeva hipoklorita prije svake uporabe kako bi se spriječila unakrsna kontaminacija između uzoraka.
b.Provjerite je li pufer za izravnu lizu biljaka potpuno otopljen prije upotrebe.Ako je pufer viskozan ili ima talog, može se zagrijati na 37 ℃ da se potpuno otopi prije upotrebe.
c.Volumen šablone u reakcijskom sustavu može se prikladno prilagoditi prema razlici u volumenu dodanog biljnog materijala i razrjeđivača.
Pufer za izravnu lizu biljaka
Pufer A za izravnu lizu biljaka sadržan u ovom proizvodu je strogo optimiziran za oslobađanje genoma većine biljnih tkiva i prikladan je za kratkotrajno skladištenje sirovih biljaka na 4 ℃.Ako uzorak treba pohraniti dulje vrijeme (npr. 1 – 2 mjeseca), preporuča se prebaciti supernatant u novu EP epruvetu i pohraniti na -20 ℃.Za stabilnije pohranjivanje uzoraka dodajte jednaki volumen Plant Direct Lysis Buffer B u preneseni supernatant, dobro promiješajte i pohranite na -20 ℃.Vrijeme stabilnog skladištenja ovisi o uzorcima i stanjima biljaka.
Reakcijski sustav
| ddH2O | Do 20,0 µl | Do 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| List biljke/uzorak sirovog ekstrakta(Pogledajte Obrada uzorka) | 0,5 – 3 mm disk lista/x µl | 0,5 – 3 mm disk lista/x µl |
a.Sadrži Mg2+u konačnoj koncentraciji od 2 mM.
b.Preporuča se koristiti konačnu koncentraciju od 0,4 μM za svaki primer.Pretjerana uporaba primera dovest će do povećane nespecifične amplifikacije.
c.Količina korištenog uzorka može se prilagoditi prema stvarnoj situaciji.Količina koja se koristi u jednoj reakciji sirovog liziranog uzorka može se podesiti između 2% – 20% ukupnog volumena reakcije.Korištenje previše uzoraka može uzrokovati neuspjeh pojačanja.
Program za reakciju
| Koraci | Temperatura | Vrijeme |
| Početna denaturacija | 98 ℃ | 5 minuta |
| Denaturacija | 95 ℃ | 10 sek |
| Žarenje | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Proširenje | 72 ℃ | 30 sek |
| Završni nastavak | 72 ℃ | 5 minuta |
a.Početna denaturacija (98 ℃, 5 min) potiče lizu biljnog tkiva, oslobađajući genomsku DNK koja se može koristiti za PCR pojačanje.Nemojte skraćivati vrijeme niti snižavati temperaturu.
b.Preporuča se postaviti ga na vrijednost Tm temeljnog premaza ili 2 ~ 4 ℃ više od vrijednosti Tm.DNA polimeraza za izravno pojačanje koja se koristi u ovom proizvodu razlikuje se od konvencionalne Taq DNA polimeraze i ima posebne zahtjeve za reakcijsku temperaturu žarenja； korištenje visoke temperature žarenja može učinkovito smanjiti nespecifično pojačanje i poboljšati učinkovitost pojačanja.Za složene predloške, učinkovito pojačanje može se postići podešavanjem temperature žarenja i produljenjem vremena produljenja.
c.Ako je duljina produkta pojačanja ≤1 kb, vrijeme produženja je postavljeno na 30 s/kb;ako je duljina produkta pojačanja >1 kb, vrijeme produženja je postavljeno na 60 s/kb.
d.Za složene uzorke ili uzorke s niskim prinosom pojačanja, broj ciklusa može se odgovarajuće povećati na 40 -50 ciklusa.
Prijave
Primjenjiv je za izravno umnožavanje biljnih tkiva i visokopropusni skrining biljnih uzoraka koji ne sadrže polisaharide i polifenole.
Bilješke
Samo za istraživačku upotrebu.Nije za upotrebu u dijagnostičkim postupcima.
1. Za sirovo biljno umnožavanje ili izravno umnažanje, preporučuje se korištenje pročišćene genomske DNK kao pozitivne kontrole prije početka eksperimenta kako bi se osiguralo da su sustav, početnice i operacije ispravni.
2. DNA polimeraza za izravno pojačanje koja se koristi u ovom priboru ima snažnu aktivnost lekture.Ako je potrebno provesti kloniranje TA, preporuča se pročistiti DNK prije dodavanja adenina.
3. Smjernice za dizajn temeljnog premaza:
a.Preporuča se da posljednja baza na 3′ kraju temeljnog premaza bude G ili C.
b.Trebalo bi izbjegavati uzastopna nepodudaranja u zadnjih 8 baza na 3' kraju početnice.c.Izbjegavajte ukosnice na 3' kraju temeljnog premaza.
d.Razlike u vrijednosti Tm prednjeg primera i obrnutog primera ne smiju biti veće od 1 ℃, a vrijednost Tm treba prilagoditi na 60 ~ 72 ℃ (Preporučuje se Primer Premier 5 za izračunavanje vrijednosti Tm).
e.Dodatne dodatne sekvence početnica koje se ne podudaraju s predloškom ne bi trebale biti uključene pri izračunavanju vrijednosti Tm početnice.
f.Preporuča se da GC sadržaj temeljnog premaza bude 40% -60%.
g.Ukupna raspodjela A, G, C i T u temeljnom premazu trebala bi biti što ravnomjernija.Izbjegavajte korištenje regija s visokim sadržajem GC ili AT.
h.Izbjegavajte prisutnost komplementarnih sekvenci od 5 ili više baza unutar početnice ili između dvije početnice i izbjegavajte prisutnost komplementarnih sekvenci od 3 ili više baza na 3' kraju dviju početnica.
jaKoristite funkciju NCBI BLAST za provjeru specifičnosti primera kako biste spriječili nespecifično pojačanje.
