M-MLV reverzna transkriptaza
RevScript Reverzna transkriptaza dobiva se tehnologijom genetskog inženjeringa.Ima veću sposobnost sinteze cDNA, toplinsku stabilnost i graničnu temperaturu reakcije (do 60°C).Sintetizirani produkt cDNA je do 10 kb.Povećava afinitet predložaka i prikladan je za obrnutu transkripciju RNA predložaka sa složenom sekundarnom strukturom ili genima s malim brojem kopija.
Komponente
| komponenta | HC2003B (10 000 U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200 000 U) |
| RevScript reverzna transkriptaza (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript međuspremnik | 250 μL | 1,25 mL | 5 mL |
Uvjet skladištenja
Ovaj proizvod treba čuvati na -25°C~-15°C 2 godine.
Definicija jedinice
Jedna jedinica uključuje 1 nmol dTTP-a u materijal netopljiv u kiselini u 10 minuta na 37°C koristeći Oligo(dT) kao početnice.
Postavljanje reakcije
1.Denaturacija RNA predloška (Ovaj korak nije obavezan, denaturacija RNA predloška pomaže otvoriti sekundarne strukture, što će poboljšati prinos prvog lanca cDNA.)
| Komponente | glasnoća (μL) |
| ddH bez RNaze2O | do 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) ili nasumični primer (50 μmol/L) Ili genski specifični primeri (2 μmol/L) | 1 |
| ili 1 | |
| ili 1 | |
| RNA predložak | X a |
Bilješke:
1) a: Ukupna RNA: 1-5 ug ili mRNA: 1-500 ng
2) Inkubacija na 65°C 5 minuta, zatim odmah prebačena na led da se ohladi 2 minute.Kratko centrifugiranje za prikupljanje reakcijske tekućine, dodajte reakcijsku otopinu obrnute transkripcije kao što je prikazano u sljedećoj tablici.Lagano pipetom promiješajte.
1.Priprema reakcijske smjese (volumen 20 μL)
| Komponente | glasnoća (μL) |
| Mješavina prethodnog koraka | 13 |
| 5×pufer | 4 |
| dNTP mješavina (10 nmol/L) | 1 |
| Reverzna transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNaze (40 U/μL) | 1 |
1.Provedite reakciju pod sljedećim uvjetima:
| Temperatura (°C) | Vrijeme |
| 25 °Ca | 5 minuta |
| 42 °Cb | 15-30 minuta |
| 85 °Cc | 5 minuta |
Bilješke:
1) a.Inkubacija na 25°C tijekom 5 minuta potrebna je samo za korištenje nasumičnih heksamera.Preskočite ovaj korak kada koristite Oligo (dT)18ili Gene Specific Primer.
2) b.Preporučena temperatura reverzne transkripcije je 42°C. Za predloške s kompliciranom sekundarnom strukturom ili visokim GC sadržajem, preporučuje se povisiti temperaturu reakcije na 50-55°C.
3) c.Grijanje na 85°C tijekom 5 minuta da se inaktivira reverzna transkriptaza.
4) Proizvod se može izravno koristiti u PCR ili qPCR reakcijama ili se može pohraniti na -20°C za kratkotrajno skladištenje.Preporuča se poravnati proizvode i čuvati na -80°C za dugotrajno skladištenje.Izbjegavajte često zamrzavanje-otapanje.
5) Proizvod je prikladan za RT-qPCR u jednom koraku, preporučuje se dodavanje 10-20 U reverzne transkriptaze za svakih 25 μL reakcijskog sustava ili postupno povećavanje količine reverzne transkriptaze u skladu sa stvarnom situacijom.
Bilješke
1.Održavajte eksperimentalno područje čistim;Tijekom rada treba nositi čiste rukavice i maske.Svi potrošni materijali korišteni u eksperimentu ne smiju sadržavati RNaze kako bi se spriječila kontaminacija RNazama.
2.Sve postupke treba izvoditi na ledu kako bi se spriječila degradacija RNK.
3.Preporučuju se visokokvalitetni uzorci RNA kako bi se osigurala visoka učinkovitost reverzne transkripcije.
4.Ovaj proizvod je samo za istraživačku upotrebu.
5.Radi vaše sigurnosti radite u laboratorijskim kutama i jednokratnim rukavicama.
