M-MLV Neoscript reverzna transkriptaza
Reverzna transkriptaza Neoscript je reverzna transkriptaza dobivena probirom mutacije M-MLV gena porijekla Moloney virusa mišje leukemije i ekspresije u E.coli.Enzim uklanja aktivnost RNaze H, ima višu temperaturnu toleranciju i prikladan je za visokotemperaturnu reverznu transkripciju.Stoga je koristan za uklanjanje nepovoljnih učinaka strukture visoke razine RNA i nespecifičnih čimbenika na sintezu cDNA, te ima veću stabilnost i sposobnost sinteze obrnute transkripcije.Enzim ima veću stabilnost i sposobnost sinteze obrnute transkripcije.
Komponente
1.200 U/μL Neoscript reverzne transkriptaze
2.5 × međuspremnik prve niti (opcionalno)
* 5 × pufer prve niti ne sadrži dNTP, dodajte dNTP prilikom pripreme reakcijskog sustava
Preporučena primjena
1.QRT-PCR u jednom koraku.
2.RNA otkrivanje virusa.
Uvjet skladištenja
-20°C za dugotrajno skladištenje, treba dobro promiješati prije upotrebe, izbjegavati često zamrzavanje-otapanje.
Definicija jedinice
Jedna jedinica uključuje 1 nmol dTTP-a u 10 minuta na 37°C koristeći poli(A)•oligo(dT)25kao predložak/primer.
Kontrola kvalitete
1.SDS-PAGE elektroforetska čistoća veća od 98%.
2.Osjetljivost pojačanja, kontrola od serije do serije, stabilnost.
3.Nema aktivnosti egzogene nukleaze, nema egzogene endonukleaze ili kontaminacije egzonukleazom
Postavljanje reakcije za prvo rješenje lančane reakcije
1.Priprema reakcijske smjese
| Komponente | Volumen |
| Oligo(dT)12-18 Primer ili Random Primera Ili početnice specifične za genb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmola | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Template RNA | Ukupna RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH bez RNaze2O | Do 10 μL |
Bilješke:a/b: Molimo odaberite različite vrste primera u skladu s vašim eksperimentalnim potrebama.
2.Zagrijte na 65°C 5 minuta i brzo ohladite na ledu 2 minute.
3.Dodajte sljedeće komponente u gornji sustav do ukupnog volumena od 20 µL i lagano promiješajte:
| Komponente | glasnoća (μL) |
| 5 × međuspremnik prve niti | 4 |
| Neoscript reverzna transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNaze (40 U/μL) | 1 |
| dH bez RNaze2O | Do 20 μL |
4. Izvedite reakciju prema sljedećim uvjetima:
(1) Ako se koristi Random Primer, reakciju treba provesti na 25 ℃ tijekom 10 minuta, a zatim na 50 ℃ tijekom 30 ~ 60 minuta;
(2) Ako se koriste Oligo dT ili specifični primeri, reakciju treba provesti na 50 ℃ 30~60 minuta.
5.Zagrijavajte na 95 ℃ 5 minuta kako biste inaktivirali Neoscript reverznu transkriptazu i prekinuli reakciju.
6.Produkti obrnute transkripcije mogu se koristiti izravno u PCR reakciji i kvantitativnoj PCR reakciji fluorescencije ili se mogu pohraniti na -20 ℃ dulje vrijeme.
PCR Rdjelovanje:
1.Priprema reakcijske smjese
| Komponente | Koncentracija |
| 10 × PCR pufer (bez dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM svaki dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA polimeraza (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Predložaka | ≤10% Prva otopina lančane reakcije (2 μL) |
| ddH2O | Do 50 μL |
Bilješke:a: Ako se doda previše otopine prve lančane reakcije, PCR reakcija može biti inhibirana.
2.Postupak PCR reakcije
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklusi |
| Preddenaturacija | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturacija | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 (prikaz, stručni). |
| Žarenje | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Proširenje | 72 ℃ | 10-60 sek |
Bilješke
1.Prikladno za optimizaciju temperature obrnute transkripcije u rasponu od 42℃~55℃.
2.Ima bolju stabilnost, pogodan je za visokotemperaturno pojačanje obrnute transkripcije.Osim toga, povoljan je za učinkovito prolaženje kroz složene strukturne regije RNA.Također, toprikladan je za kvantitativnu RT-PCR detekciju multipleksne fluorescencije u jednom koraku.
3.Dobra kompatibilnost s raznim PCR enzimima za amplificiranje i pogodan je za visokoosjetljive RT-PCR reakcije.
4.Prikladno za visokoosjetljivu kvantitativnu RT-PCR reakciju fluorescencije u jednom koraku, učinkovito poboljšava stopu detekcije niske koncentracije šablona.
5.Prikladno za izgradnju cDNA knjižnice.
