Mini komplet za ekstrakciju DNK
Ovaj komplet koristi optimizirani sustav pufera i tehnologiju pročišćavanja na stupcu silikagela, koja može obnoviti fragmente DNK od 70 bp – 20 kb iz različitih koncentracija TAE ili TBE agaroznog gela.DNK adsorpcijska kolona može posebno adsorbirati DNK u uvjetima s visokim sadržajem soli.Osim toga, kit može izravno pročistiti fragmente DNA iz PCR proizvoda, enzimskih reakcijskih sustava ili sirovih DNA proizvoda dobivenih drugim metodama, te ukloniti nečistoće poput proteina, drugih organskih spojeva, iona anorganske soli i oligonukleotidnih početnica.Može osigurati da se pročišćavanje može završiti unutar 10-15 minuta.Pročišćena DNA može se koristiti izravno za ligaciju, transformaciju, enzimsku probavu, in vitro transkripciju, PCR, sekvenciranje, mikroinjekciju itd.
Uvjeti skladištenja
Čuvati na -15 ~ -25 ℃ i transportirati na sobnoj temperaturi.
Komponente
| Komponente | (100 rxns) |
| tampon BDP | 80 ml |
| Međuspremnik GW | 2 × 20 ml |
| Elucijski pufer | 20 ml |
| Mini stupci FastPure DNA-G | 100 |
Međuspremni BDP:pufer za vezanje DNA.
Međuspremnik GW:pufer za pranje;dodajte apsolutni etanol do naznačenog volumena na bočici prije upotrebe.
Pufer za ispiranje:Eluiranje.
Mini stupci FastPure DNA-G:DNA adsorpcijske kolone.
Tube za prikupljanje 2 ml:Cijevi za sakupljanje filtrata.
Pripremljeni materijali
Sterilizirane epruvete od 1,5 ml, apsolutni etanol i izopropanol (kada je fragment DNA ≤100 bp, dodajte 1 volumen
izopropanol na 1 volumen gela), vodena kupelj.
Eksperimentalni proces
Dodajte 80 ml etanola za razrjeđivanje pufera GW kako je naznačeno na etiketi prije upotrebe, čuvajte na sobnoj temperaturi.
Mehanizam
1. PCR reakcijska otopina
Shema ekstrakcije gela: Dodajte jednaki volumen pufera GDP PCR reakcijske otopine Shema oporavka:Dodajte 5 puta veći volumen pufera
2. GDP Izračunajte volumen gela (100 μl jednako 100 mg )
Otopiti gel
3. Zagrijte na 50 ~ 55℃
4. Pranje uveza
Dodajte 300 μL međuspremnika GDP*
Dodajte 700 μL pufera GW
Dodajte 700 μL pufera GW
5. Eluirati
Dodajte 20 – 30 μL pufera za eluiranje ili deionizirane vode
Napomene* Oporavak PCR reakcijske tekućine bez ovog koraka
Program za ekstrakciju gela
1. Nakon DNA elektroforeze za frakcioniranje fragmenata DNA, izrežite jednu traku fragmenta DNA iz agaroznog gela pod UV svjetlom.Preporuča se koristiti upijajući papir za upijanje prividne vlage gela i smanjivanje veličine kriške gela uklanjanjem viška agaroze što je više moguće.Izvažite krišku gela (bez epruvete za mikrocentrifugiranje) kako biste izračunali njegov volumen: Volumen rezine gela od 100 mg je približno 100 μL, uz pretpostavku da je gustoća 1 g/ml.
2. Dodajte jednaki volumen GDP pufera, inkubirajte na 50~55 ℃ 7-10 minuta (prema veličini gela, prilagodite vrijeme inkubacije dok se gel potpuno ne otopi).Okrenite epruvetu 2 puta tijekom inkubacije.
Δ Dodavanje 1-3 volumena pufera GDP neće utjecati na učinkovitost oporavka DNK.Ako je fragment DNA koji se želi obnoviti <100 bp, potrebno je dodati 3 volumena puferskog GDP-a;kada se kriška gela potpuno otopi, dodajte 1 volumen izopropanola i dobro promiješajte, zatim nastavite na sljedeći korak.
3. Kratko centrifugirajte da uzorak dođe na dno epruvete, umetnite FastPure DNA Mini Columns-G u epruvete za prikupljanje od 2 ml, pažljivo prenesite otopinu maksimalno 700 μL jednom
vrijeme do filtracijskih kolona, centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 X g) 30-60 sekundi.
4. Odbacite filtrat i dodajte 300 μL pufera GDP u kolonu, inkubirajte na sobnoj temperaturi 1 minutu, centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 X g) 30-60 sekundi.
5. Odbacite filtrat i dodajte 700 μL pufera GW (provjerite da li je apsolutni etanol dodan unaprijed!) u kolonu, centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 X g) 30-60 sekundi.
Δ Dodajte pufer GW oko stjenke adsorpcijske kolone ili dodajte stražnji poklopac pufera GW i promiješajte ga naopačke 2 – 3 puta kako biste potpuno isprali sol koja se zalijepila za stjenke cijevi.
6. Ponovite korak 5.
Δ Ispiranje puferom GW dva puta može osigurati potpuno uklanjanje soli i eliminirati utjecaj na sljedeće pokuse.
7. Odbacite filtrat i centrifugirajte praznu kolonu na 12 000 okretaja u minuti (13 800 X g) 2 minute.
8. Umetnite kolonu u čistu epruvetu mikrocentrifuge od 1,5 ml, dodajte 20 - 30 μL pufera za eluiranje u središte membrane kolone, inkubirajte 2 minute, a zatim centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 X g) 1 minutu.Bacite kolonu, a dobivenu DNA pohranite na -20 .
Δ Prijenos supernatanta iz koraka 8 u kolonu za ponovno eluiranje i prethodno zagrijavanje pufera za eluiranje na 55 (kada je fragment DNA >3 kb) može biti od pomoći za povećanje učinkovitosti oporavka.
Program oporavka PCR proizvoda
Ovaj je protokol primjenjiv za pročišćavanje fragmenata DNA iz PCR proizvoda, enzimskog reakcijskog sustava i drugih sirovih proizvoda DNA (uključujući genetsku DNA).Ova otopina može učinkovito ukloniti različite nukleotide, primere, dimere primera, molekule soli, enzime i druge nečistoće.
1. Nakratko centrifugirajte PCR produkte, enzimsku reakcijsku otopinu i druge sirove DNK proizvode.Procijenite njihov volumen pipetom i prenesite u steriliziranu epruvetu od 1,5 ml ili 2 ml.Dodati ddH2O do volumena do 100 μL;dok će za genomsku DNA s visokom koncentracijom, razrjeđivanje na 300 μL s ddH2O pomoći poboljšati učinkovitost oporavka.
2. Dodajte 5 volumena pufera GDP, temeljito promiješajte okretanjem ili vorteksiranjem.Ako je DNA fragment od interesa >100 bp, potrebno je dodati dodatnih 1,5 volumena (uzorci + GDP pufera) etanola.
3. Umetnite kolonu natrag u epruvetu za sakupljanje, prenesite mješavinu u kolonu, centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 × g) 30 – 60 sekundi.Ako je volumen miješane otopine >700 µL, vratite adsorpcijsku kolonu u epruvetu za sakupljanje, prenesite preostalu otopinu u adsorpcijsku kolonu i centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti (13 800 × g) 30 – 60 sekundi.
4. Sljedeća izvedba odnosi se na korake 5 – 8 programa 08-1/Gel ekstrakcija.
Prijave
Različite koncentracije TAE ili TBE agaroznog gela;PCR proizvodi, enzimski reakcijski sustavi ili drugi sirovi DNK proizvodi dobiveni različitim metodama.Izvađeni fragmenti kretali su se od70 bp -20 kb.
Bilješke
Samo za istraživačku upotrebu.Nije za upotrebu u dijagnostičkim postupcima.
1. Dodajte 80 ml etanola u razrijeđeni pufer GW kako je naznačeno na naljepnici prije upotrebe, čuvajte na sobnoj temperaturi.
2. Ako se pufer GDP lako taloži tijekom skladištenja na niskim temperaturama, može se staviti na sobnu temperaturu neko vrijeme prije upotrebe.Ako je potrebno, može se prethodno zagrijati u vodenoj kupelji na 37 ℃ dok se talog potpuno ne otopi, a zatim se može koristiti nakon miješanja.
3. Unaprijed postavite temperaturu vodene kupelji na 50 ~55 ℃.
4. U 1. koraku programa 08-1/Gel ekstrakcija, minimiziranje veličine kriške gela značajno će smanjiti vrijeme otapanja i povećati učinkovitost oporavka (Linearizirana DNK lako se hidrolizira ako je stalno izložena visokoj temperaturi).Ne izlažite DNK gel UV zračenju dulje vrijeme jer ultraljubičasto svjetlo može uzrokovati oštećenje DNK.
5. Potpuno otopite gel u koraku 2 programa 08-1/Gel ekstrakcija, inače će učinkovitost oporavka DNK biti ozbiljno ugrožena.
6. Prethodno zagrijte pufer za eluiranje ili ddH2O na 55 ℃, što je korisno za poboljšanje učinkovitosti eluiranja DNK.Preporuča se čuvanje DNA u eluensu od 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
