2×Sensi Direct Premix-UNG (sonda qPCR)
Kataloški broj: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) dizajniran je za izvođenje PCR-a izravno iz uzoraka bez ekstrakcije DNK ili pripreme uzorka.Ovaj reagens sastoji se od DNA polimeraze vrućeg starta, uracil DNA glikozilaze (UNG), inhibitora RNaze, MgCl2, dNTP (s dUTP umjesto dTTP) i stabilizatore za kvantitativni PCR (qPCR).Ovaj reagens stvara visoku toleranciju na inhibitore, pa se može izravno primijeniti na detekciju uzoraka poput brisa grla, sline, antikoagulirane pune krvi, plazme i seruma bez ekstrakcije DNK.Reagens koristi zaštićeni pufer za qPCR s miješanim enzimima antiinhibitorne DNA polimeraze i enzima UNG.Stoga može postići dobro umnažanje ciljnih gena u uzorcima koji sadrže inhibitore i inhibirati lažno pozitivno umnažanje uzrokovano zaostalim PCR-om i zagađenjem aerosolom.Ovaj reagens je kompatibilan s većinom fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumenata, kao što su Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche i tako dalje.
Komponente
1. 50×SensiDirect enzim/UNG mješavina
2. 2×SensiDirect međuspremnik prethodnog miješanja (dUTP)
Uvjeti skladištenja
Sve komponente treba čuvati na -20 ℃ za dugotrajno skladištenje i 4 ℃ do 3 mjeseca.Dobro promiješajte nakon odmrzavanja i centrifugirajte prije upotrebe.Izbjegavajte često zamrzavanje-otapanje.
Biciklistički protokol
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklus |
| Digestija | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivacija polimeraze | 95 ℃ | 1-5 min | 1 |
| Denaturirati | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 (prikaz, stručni). |
| Žarenje/proširenje | 56-64 ℃ | 20-60-ih godina |
Upute za pipetiranje
| Reagens | Volumen po reakcija | Volumen po reakciji | Konačna koncentracija |
| 2×SensiDirect međuspremnik za prethodno miješanje (dUTP) | 12,5 µL | 25 µL | 1× |
| 50×SensiDirect enzim/UNG mješavina | 0,5 µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Uzorak3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Ukupni volumen | 25 μL | 50 μL | - |
1. Konačna koncentracija primera obično je 0,2 μM.Za bolje rezultate, koncentracija primera može se optimizirati unutar raspona od 0,2-1 μM.
2. Općenito, koncentracija sonde može se optimizirati unutar raspona od 0,1-0,3 μM.Optimalna koncentracija sonde povezana je s instrumentom za PCR pojačanje u stvarnom vremenu, vrstom sonde i vrstom fluorescentne tvari za označavanje.Molimo pogledajte priručnik za instrument ili specifične zahtjeve svake fluorescentne sonde.
3. Različite vrste uzoraka sadrže različite vrste i sadržaj inhibitora i broj kopija ciljnog gena.Volumen uzorka treba uzeti u obzir prema stvarnom stanju.Napravite razrijeđenje uzorka dodavanjem vode bez nukleaza ili TE pufera, ako je potrebno.
4. Preporučeni volumen različitih uzoraka:
| Uzorak | Volumen za jedan 50 μL reakcija | Maksimum omjer |
| Antikoagulirana puna krv | 2,5 μL | 5% |
| Plazma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Bris grla | 10 μL | 20% |
| Slina | 10 μL | 20% |
Kontrola kvalitete
1. Detekcija funkcije: osjetljivost, specifičnost i ponovljivost qPCR-a.
2. Nema aktivnosti egzogene nukleaze: nema zagađenja egzogenom endonukleazom i egzonukleazom.
Bilješke o proizvodu
1. Ovaj proizvod koristi novi tip DNA polimeraze s vrućim startom, koja se može aktivirati za 1-5 minuta. Budući da je njegov reakcijski pufer optimiziran, prikladniji je za dvostruku ili višestruku fluorescentnu kvantitativnu PCR pomoću metode sonde.
2. Ako je Rn vrijednost PCR amplifikacije preniska ili je amplifikacija očito inhibirana, smanjenje količine uzorka, povećanje volumena reakcije ili prethodno razrjeđivanje uzorka mogu poboljšati rezultate.
3. Prikupljanje krvi, sline, urina, brisa grla itd. treba slijediti zahtjeve kliničkih kriterija, a svježi uzorak može se koristiti za sprječavanje razgradnje nukleinske kiseline.
4. Budući da različiti amplikoni imaju različitu učinkovitost iskorištavanja u odnosu na dUTP i osjetljivost na UNG, reagense treba optimizirati ako se osjetljivost detekcije smanji pri korištenju UNG sustava.Kontaktirajte nas za tehničku podršku ako je potrebna.
5. Kako bi se izbjeglo umnažanje produkata prijenosa PCR između reakcija u jednom koraku, za umnožavanje su potrebni namjenski eksperimentalni prostor i pipeta.Radite s rukavicama i često ih mijenjajte te nemojte otvarati reakcijsku epruvetu nakon PCR pojačanja.
