RTL reverzna transkriptaza
RTL reverzna transkriptaza je DNA polimeraza ovisna o RNA šabloni kojoj nedostaje aktivnost 3'→5' egzonukleaze i ima aktivnost RNaze H.Ovaj enzim može koristiti RNA kao predložak za sintezu komplementarnog lanca DNA, koji se može primijeniti na sintezu prvog lanca cDNA, posebno za RT-LAMP (izotermno pojačanje posredovano petljom).U usporedbi s RTL reverznom transkriptazom 1.0, osjetljivost je značajno poboljšana, toplinska stabilnost je jača, a reakcija na 65°C je stabilnija.RTL reverzna transkriptaza (bez glicerola) može se koristiti za pripremu liofiliziranih pripravaka, liofiliziranih RT-LAMP reagensa itd.
Definicija jedinice
Jedna jedinica uključuje 1 nmol dTTP-a u materijal koji se može istaložiti kiselinom u 20 minuta na 50°C koristeći poli(A)•oligo(dT)25 kao predložak-primer.
Komponente
| komponenta | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverzna transkriptaza (bez glicerola) (15U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10×HC RTL međuspremnik | 1,5 mL | 4×1,5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 mL | 2×1,5 mL | 3×10 ml |
Uvjet skladištenja
Prijevoz ispod 0°C i skladištenje na -25°C~-15°C.
Kontrola kvalitete
- Preostala aktivnost odEndonukleaza:Reakcija od 50 μL koja sadrži 1 μg λDNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubirana 16 sati na 37 ℃ pokazuje isti uzorak kao negativna kontrola elektroforezom u gelu.
- Preostala aktivnost odegzonukleaza:Reakcija od 50 μL koja sadrži 1 μg Hind Ⅲ digestirane λDNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubirana 16 sati na 37 ℃ pokazuje isti uzorak kao negativna kontrola elektroforezom u gelu.
- Preostala aktivnost odNickase:Reakcija od 50 µL koja sadrži 1 µg supersmotanog pBR322 i 15 jedinica RTL2.0 inkubirana 4 sata na 37°C pokazuje isti uzorak kao negativna kontrola elektroforezom u gelu.
- Preostala aktivnost odRNaza:Reakcija od 10 µL koja sadrži 0,48 µg MS2 RNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubirana 4 sata na 37°C pokazuje isti uzorak kao negativna kontrola elektroforezom u gelu.
- E coli gDNK:Mjereno sE colispecifični setovi za otkrivanje HCD，15 jedinica RTL2.0 sadrži manje od 1E coligenom.
Postavljanje reakcije
Protokol sinteze cDNA
| Komponente | Volumen |
| Template RNA a | neobavezan |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ili Random Primer mix (60uM) | 2 μL |
| dNTP mješavina (10 mM svaki) | 1 μL |
| Inhibitor RNaze (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL reverzna transkriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL međuspremnik | 2 μL |
| Voda bez nukleaza | Do 20 μL |
Bilješke:
1) Preporučena doza Total RNA je 1ng~1μg
2) Preporučena doza mRNA bila je 50ng~100ng
Termo-biciklizam Uvjeti za rutinu reakcija:
| Temperatura (°C) | Vrijeme |
| 25 °Ca | 5 minuta |
| 55 °C | 10 minutab |
| 80 °C | 10 minuta |
Bilješke:
1) Ako se koristi Random Primer Mix, korak inkubacije na 25°C.
2) Ako se koristi ciljna mješavina primera, korak inkubacije na 55°C tijekom 10~30 minuta.
RT-LAMP protokol
| Komponente | Volumen | Konačna koncentracija |
| Template RNA | neobavezan | ≥10 primjeraka |
| dNTP mješavina (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primeri (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primeri (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primeri (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibitor RNaze (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reakcija |
| RTL reverzna transkriptaza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/reakcija |
| Bst V2 DNA polimeraza (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reakcija |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (ukupno 8 mM) |
| 10×HC RTL međuspremnik (ili 10×HC Bst V2 međuspremnik) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Voda bez nukleaza | Do 25 μL | - |
Bilješke:
1) Promiješajte vrtloženjem i kratko centrifugirajte da se sakupi.Inkubacija na konstantnoj temperaturi na 65°C tijekom 1 sata.
2) Dva međuspremnika su interoperabilna i imaju isti sastav.
Bilješke
1. Ovaj će proizvod stvoriti bijelu krutinu kada se čuva na -20 °C.Izvadite iz -20°C i stavite na led oko 10 minuta.Nakon otapanja može se koristiti mućkanjem i miješanjem.
2. Proizvod cDNA može se pohraniti na -20°C ili -80°C ili se odmah upotrijebiti za PCR reakciju.
3. Kako biste spriječili kontaminaciju RNazom, održavajte eksperimentalno područje čistim i nosite čiste rukavice i maske tijekom rada.
