Enzim za zatvaranje virusa vakcinije

Enzim za zatvaranje virusa vakcinije izveden je iz rekombinantnog soja E. coli koji nosi gene za zatvaranje enzima za vakciniju.Ovaj pojedinačni enzim sastoji se od dvije podjedinice (D1 i D12) i ima tri enzimske aktivnosti (RNA trifosfatazu i gvanililtransferazu D1 podjedinice i gvanin metiltransferazu D12 podjedinice).Enzim za pokrivanje virusa vakcinije učinkovit je u kataliziranju stvaranja kap strukture, koja može specifično pričvrstiti kap strukturu 7-metilgvanilata (m7Gppp, Cap 0) na 5' kraj RNA.Cap struktura (Cap 0) igra važnu ulogu u stabilizaciji, transportu i translaciji mRNA u eukariota.Zatvaranje RNA enzimatskom reakcijom je učinkovita i jednostavna metoda koja može značajno poboljšati stabilnost i translaciju RNA za in vitro transkripciju, transfekciju i mikroinjekciju.

Komponente

Enzim za zatvaranje virusa vakcinije (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Uvjeti skladištenja

-25～- 15℃ za skladištenje （ Izbjegavajte ponovljene cikluse smrzavanja i odmrzavanja）

Međuspremnik za pohranu

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol.

Definicija jedinice

Jedna jedinica enzima za pokrivanje virusa vakcinije definirana je kao količina enzima potrebna za ugradnju 10 pmol GTP-a u 80nt transkript u 1 satu na 37°C.

Kontrola kvalitete

egzonukleaza:10U enzima za pokrivanje virusa vakcinije s 1 μg λ-Hind III digestirane DNA na 37 ℃ tijekom 16 sati ne dovodi do razgradnje što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.

endonukleaza:10U enzima za pokrivanje virusa vakcinije s 1 μg λDNA na 37 ℃ tijekom 16 sati ne daje razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.

Nadimak:10U enzima za pokrivanje virusa vakcinije s 1 μg pBR322 na 37 ℃ tijekom 16 sati ne daje razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.

RNaza:10U enzima za pokrivanje virusa vakcinije s 1,6 μg MS2 RNA tijekom 4 sata na 37 ℃ ne izaziva razgradnju što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.

1.coli DNK:10U enzima za pokrivanje virusa vakcinije pregledava se na prisutnost genomske DNK E. coli pomoću TaqMan qPCR s početnicama specifičnim za lokus 16S rRNA E. coli.Kontaminacija genomske DNK E. coli je ≤1 genoma E. coli.

2.Bakterijski Endotoksin: LAL-test, prema izdanju Kineske farmakopeje IV iz 2020., metoda ispitivanja granice gela, opće pravilo (1143).Sadržaj bakterijskog endotoksina trebao bi biti ≤10 EU/mg.

Reakcijski sustav i uvjeti

1. Protokol zatvaranja (reakcijski volumen: 20 μL)

Ovaj je postupak primjenjiv na reakciju zatvaranja 10 μg RNA (≥100 nt) i može se povećati u skladu s eksperimentalnim zahtjevima.

I) Pomiješajte 10 μg RNA i H2O bez nukleaze u epruveti za mikrocentrifugu od 1,5 ml do konačnog volumena od 15,0 µL.*10×pufer za zatvaranje: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Zagrijte na 65 ℃ 5 minuta, a zatim u ledenoj kupelji 5 minuta.

3) Dodajte sljedeće komponente navedenim redoslijedom

*10×pufer za zatvaranje: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubirajte na 37°C 30 minuta, RNA je sada zatvorena i spremna za daljnju primjenu.

2. 5′ terminal reakcija označavanja (reakcijski volumen: 20 μL)

Ovaj je protokol dizajniran za označavanje RNK koja sadrži 5´ trifosfat i može se povećati prema zahtjevima.Na učinkovitost ugradnje oznake utjecat će molarni omjer RNA:GTP, kao i sadržaj GTP-a u uzorcima RNA.

1) Pomiješajte odgovarajuću količinu RNA i H2O bez nukleaze u epruveti za mikrocentrifugu od 1,5 ml do konačnog volumena od 14,0 µL.

2) Zagrijte na 65 ℃ 5 minuta, a zatim u ledenoj kupelji 5 minuta.

3) Dodajte sljedeće komponente navedenim redoslijedom.

** GTP MIX odnosi se na GTP i mali broj markera.Za koncentraciju GTP pogledajtena bilješku 3.

4) Inkubirajte na 37°C 30 minuta, RNA 5' kraj je sada označen i spreman za nizvodno

Prijave

1. Zatvaranje mRNA prije testova translacije/in vitro translacije

2. Označavanje 5´ kraja mRNA

Napomene o korištenju

1.Zagrijavanje otopine RNA prije inkubacije s enzimom za pokrivanje vakcinije uklanja sekundarnu strukturu na 5´kraju transkripta.Produljite vrijeme na 60 minuta za prijepise s poznatim visoko strukturiranim 5´endovima.

2. RNA koja se koristi za reakcije zatvaranja treba se pročistiti prije upotrebe i suspendirati u vodi bez nukleaza.EDTA ne smije biti prisutna i otopina ne smije sadržavati soli.

3. Za obilježavanje 5´ kraja, ukupna koncentracija GTP-a trebala bi biti oko 1-3 puta veća od molarne koncentracije mRNA u reakciji.

4. Volumen reakcijskog sustava može se povećati ili smanjiti u skladu sa stvarnim.