PNGase F
Peptid-N-glikozidaza F (PNGase F) je najučinkovitija enzimatska metoda za uklanjanje gotovo svih N-vezanih oligosaharida iz glikoproteina.PNGaza F je amidaza, koja cijepa između najdubljih GlcNAc i asparaginskih ostataka visokomanoznih, hibridnih i složenih oligosaharida iz N-povezanih glikoproteina.
Primjena
Ovaj enzim je koristan za uklanjanje ostataka ugljikohidrata iz proteina.
Priprema i specifikacija
| Izgled | Bezbojna tekućina |
| Čistoća proteina | ≥95% (sa SDS-PAGE) |
| Aktivnost | ≥500 000 U/mL |
| egzoglikozidaza | Nije bilo moguće otkriti aktivnost (ND) |
| Endoglikozidaza F1 | ND |
| Endoglikozidaza F2 | ND |
| Endoglikozidaza F3 | ND |
| Endoglikozidaza H | ND |
| Proteaza | ND |
Svojstva
| EC broj | 3.5.1.52(Rekombinantno iz mikroorganizma) |
| Molekularna težina | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična točka | 8. 14 |
| Optimalni pH | 7,0-8,0 |
| Optimalna temperatura | 65 °C |
| Specifičnost supstrata | Cijepanje glikozidnih veza između GlcNAc i ostataka asparagina Sl.1 |
| Mjesta za prepoznavanje | N-vezani glikani osim ako ne sadrže α1-3 fukozu, sl. 2 |
| Aktivatori | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Temperatura skladištenja | -25 ~ -15 ℃ |
| Inaktivacija toplinom | Reakcijska smjesa od 20 µL koja sadrži 1 µL PNGase F inaktivira se inkubacijom na 75 °C tijekom 10 minuta. |
Slika 1 Specifičnost supstrata PNGase F
Slika 2 Mjesta prepoznavanja PNGase F.
Kada su unutarnji GlcNAc ostaci povezani s α1-3 fukozom, PNGase F ne može odcijepiti N-vezane oligosaharide od glikoproteina.Ova modifikacija je uobičajena u glikoproteinima biljaka i nekih insekata.
Ckomponente
|
| Komponente | Koncentracija |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glikoproteinski denaturirajući pufer | 1000 µl |
| 3 | 10×Glikopufer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definicija jedinice
Jedna jedinica (U) definirana je kao količina enzima potrebna za uklanjanje >95% ugljikohidrata iz 10 µg denaturirane RNaze B u 1 satu na 37°C u ukupnom reakcijskom volumenu od 10 µL.
Uvjeti reakcije
1. Otopite 1-20 µg glikoproteina s deioniziranom vodom, dodajte 1 µl 10× pufera za denaturaciju glikoproteina i H2O (ako je potrebno) da dobijete ukupni reakcijski volumen od 10 µl.
2.Inkubirajte na 100°C 10 minuta, ohladite na ledu.
3.Dodajte 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 i promiješajte.
4.Dodajte 1-2 µl PNGase F i H2O (ako je potrebno) kako bi se dobio ukupni reakcijski volumen od 20 µl i promiješajte.
5.Inkubirajte reakciju na 37°C 60 minuta.
6.Za SDS-PAGE analizu ili HPLC analizu.
