Dvolančana RNA (dsRNA) ELISA KIT

Ovaj komplet je enzimski imunosorbentni test (ELISA) povezan sa sustavom biotin-streptavidin, za kvantitativno mjerenje dsRNA duljine iznad 60 parova baza (bp), bez obzira na sekvencu.Ploča je prethodno obložena anti-dsRNA antitijelima.dsRNA prisutna u uzorku se dodaje i veže na antitijela obložena na jažicama.Zatim se doda biotinilirano anti-dsRNA protutijelo koje se veže za dsRNA u uzorku.Nakon ispiranja dodaje se HRP-streptavidin koji se veže na biotinilirano anti-dsRNA protutijelo.Nakon inkubacije nevezani HRP-Streptavidin se ispere.Zatim se dodaje otopina supstrata TMB i katalizira HRP da bi se proizveo proizvod plave boje koji se promijenio u žutu nakon dodavanja kisele stop otopine.Gustoća žute boje proporcionalna je ciljanoj količini dsRNA uhvaćenoj u ploču.Apsorpcija se mjeri na 450 nm.

Primjena

Ovaj pribor je za kvantitativno mjerenje rezidualne dsRNA.

Komponente kompleta

Skladištenje i stabilnost

1. Za neiskorišteni komplet: cijeli komplet može se čuvati na 2~8 ℃ tijekom roka trajanja.Zbog stabilnosti skladištenja treba izbjegavati jako svjetlo.

2. Za iskorišteni komplet: nakon što se mikropločica otvori, pokrijte neiskorištene jažice sredstvom za brtvljenje pločica i vratite je u vrećicu od folije koja sadrži pakiranje sredstva za sušenje, zatvorite vrećicu od folije i vratite je na 2~8 ℃ što je prije moguće nakon upotrebe.Ostale reagense treba vratiti na 2~8 ℃ što je prije moguće nakon upotrebe.

Potrebni materijali koji nisu isporučeni

1. Čitač mikropločica s filtrom od 450±10 nm (bolje ako može detektirati na valnoj duljini od 450 i 650 nm).

2. Mućkalica za mikropločice.

3. Vrhovi i epruvete za centrifugiranje bez RNaze.

Dijagram toka operacije

Prije nego što počneš

1. Stavite sve komponente kompleta i uzorke na sobnu temperaturu (18-25 ℃) prije upotrebe.Ako se komplet neće potrošiti odjednom, izvadite samo trake i reagense za ovaj eksperiment, a preostale trake i reagense ostavite u traženom stanju.

2. Pufer za ispiranje: razrijedite 40 mL 20x koncentriranog pufera za ispiranje sa 760 mL deionizirane ili destilirane vode kako biste pripremili 800 mL 1x pufera za ispiranje.

3. Standardno: prije upotrebe kratko zavrtite ili centrifugirajte temeljnu otopinu.Koncentracija četiri standarda je 5 ng/μL.Za standarde UTP i pUTP dsRNA, razrijedite temeljnu otopinu na 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivulju.Za standarde N1-Me-pUTP dsRNA, molimo razrijedite temeljnu otopinu na 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivulju.Za standard 5-OMe-UTP dsRNA, molimo razrijedite temeljnu otopinu na 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0 pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivulju.Preporučujemo da se standardi mogu razrijediti kao sljedeće tablice:

4. Biotinilirano protutijelo za detekciju i radna otopina HRP-streptavidina: prije upotrebe kratko zavrtite ili centrifugirajte temeljnu otopinu.Razrijedite ih do radne koncentracije puferom za razrjeđivanje.

5. TMB supstanje: aspirirajte potrebnu dozu otopine steriliziranim vrhovima i nemojte ponovno sipati zaostalu otopinu u bočicu.TMB supstrat je osjetljiv na svjetlost, nemojte izlagati TMB supstrat svjetlu dulje vrijeme.

Korištenje protokola

1. Odredite broj traka potrebnih za analizu.Umetnite trake u okvire za upotrebu.Preostale trake pločica koje se ne koriste u ovom testu treba ponovno upakirati u vrećicu sa sredstvom za sušenje.Čvrsto zatvorite vrećicu za skladištenje u hladnjaku.

2. Dodajte 100 μL svakog od razrjeđenja standarda, slijepe probe i uzoraka u odgovarajuće jažice.Pokrijte sredstvom za brtvljenje ploča.Inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri 500 okretaja u minuti.Uzorke treba razrijediti STE puferom do odgovarajuće koncentracije za točnu analizu.

3. Korak ispiranja: Aspirirajte otopinu i isperite s 250 μL pufera za ispiranje u svaku jažicu i ostavite stajati 30 sekundi.U potpunosti odbacite pufer za pranje tako što ćete ploču staviti na upijajući papir.Potpuno oprati 4 puta.

4. Dodajte 100 μL radne otopine biotiniliranih antitijela za detekciju u svaku jažicu.Pokrijte sredstvom za brtvljenje ploča.Inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri 500 okretaja u minuti.

5. Ponovite korak pranja.

6. Dodajte 100 μL radne otopine HRP-streptavidina u svaku jažicu.Pokrijte sredstvom za brtvljenje ploča.Inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri 500 okretaja u minuti.

7. Ponovno ponovite korak pranja.

8. Dodajte 100 μL otopine TMB supstrata u svaku jažicu.Pokrijte sredstvom za brtvljenje ploča.Inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi Zaštitite od svjetlosti.Tekućina će postati plava dodatkom otopine supstrata.

9. Dodajte 50 μL stop otopine u svaku jažicu.Tekućina će požutjeti dodatkom stop otopine.Zatim pokrenite čitač mikropločica i odmah provedite mjerenje na 450 nm.

Izračun rezultata

1. Izračunajte prosjek dvostrukih očitanja za svaki standard, kontrolu i uzorke i oduzmite prosječnu nultu standardnu ​​optičku gustoću.Konstruirajte standardnu ​​krivulju s apsorbancijom na okomitoj (Y) osi i koncentracijom dsRNA na vodoravnoj (X）osi).

2. Preporuča se izvršiti izračun pomoću računalnog softvera za prilagođavanje krivulje kao što je curve expert 1.3 ili ELISA Calc u modelu nelinearnog prilagođavanja s 5 ili 4 parametra.

Izvođenje

1. Osjetljivost:

donja granica detekcije: ≤ 0,001 pg/μL (za UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (za 5-OMe-UTP-dsRNA).

donja granica kvantifikacije:0,0156 pg/μL (za UTP-, pUTP-dsRNA),0,0312 pg/μL (za N1-Me-pUTP-dsRNA),0,0625 pg/μL (za 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Preciznost: CV intra-eseja ≤10%, CV inter-eseja ≤10%

3. Oporavak: 80%~120%

4.Linearnost:0,0156-0,5pg/μL(zaUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(zaN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(za 5-OMe-UTP-dsRNA).

Razmatranja

1. Temperatura i vrijeme TMB reakcije su kritični, molimo kontrolirajte ih strogo u skladu s uputama.

2. Kako bi se postigla dobra reproducibilnost i osjetljivost testa, neophodno je pravilno pranje ploča kako bi se uklonio višak neizreagiranih reagensa.

3. Sve reagense treba temeljito promiješati prije upotrebe i izbjeći stvaranje bubuljica tijekom dodavanja uzorka ili reagensa.

4. Ako su se kristali stvorili u koncentriranom puferu za pranje (20x), zagrijte ga na 37 ℃ i lagano miješajte dok se kristali potpuno ne otope.

5. Izbjegavajte analizu uzoraka koji sadrže natrijev azid (NaN3), jer bi mogao uništiti aktivnost HRP-a što bi rezultiralo podcjenjivanjem količine dsRNA.

6. Izbjegavajte kontaminaciju RNazom tijekom analize.

7. Standard/uzorak, protutijela za otkrivanje i SA-HRP također se mogu provesti na sobnoj temperaturi bez mućkanja, ali to može uzrokovati jednostruko smanjenje osjetljivosti detekcije.Za ovaj slučaj preporučujemo da se standardi UTP i pUTP dsRNA razrijede od 2 pg/μL, standardi N1-Me-pUTP dsRNA trebaju se razrijediti od 4 pg/μL, a standard 5-OMe-UTP dsRNA treba razrijediti od 8 pg/μL.Osim toga, inkubirajte HRP-streptavidin radnu otopinu 60 minuta na sobnoj temperaturi.Nemojte koristiti mućkalicu jer tresilica boca može rezultirati netočnim rezultatom.

Tipičan rezultat

1. Podaci o standardnoj krivulji

2. Izračun standardne krivulje

3. Raspon detekcije obloge: 0,0312- 1 pg/μL