5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kataloški broj: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) vrlo je stabilna mješavina na bazi sonde u jednoj epruveti pogodna za reverznu transkripciju u jednom koraku i kvantitativni PCR (qRT-PCR).Podržava prethodno miješanje primera i sondi i ostaje stabilan nakon dugotrajnog skladištenja na niskim temperaturama.Uzorak koji se testira može se dodati izravno tijekom upotrebe, bez dodatnog otvaranja cijevi/pipetiranja.Ovaj proizvod sadrži komponente, npr. vruću DNA polimerazu, M-MLV, toplinski labilnu uracil DNA glikozilazu (TS-UNG), inhibitor RNaze, MgCl2, dNTP (s dUTP umjesto dTTP) i stabilizatore.S genetski modificiranom reverznom transkriptazom za brzo umnažanje i DNA polimerazom moguće je dovršiti PCR umnožavanje unutar 20-40 minuta.Ovaj reagens koristi poseban pufer za qPCR s miješanim enzimima antiinhibitornog enzima za pojačavanje i enzima UNG.Stoga se može postići dobra amplifikacija ciljnih gena i spriječiti lažna amplifikacija uzrokovana rezidualnim PCR-om i zagađenjem aerosolom.Ovaj reagens je kompatibilan s većinom fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumenata proizvođača kao što su Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche.
komponenta
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG mješavina
2.5×Neoscript Fast RT predspremnik za prethodno miješanje (dUTP)
Uvjeti skladištenja
Sve komponente treba čuvati na -20 ℃ za dugotrajno skladištenje i 4 ℃ do 3 mjeseca.Dobro promiješajte nakon odmrzavanja i centrifugirajte prije upotrebe.Izbjegavajte često zamrzavanje-otapanje.
Priprema qRT-PCR reakcijskog sustava
| Komponente | 25μLSustav | 50μLSustav | Konačna koncentracija |
| 5×Neoscript Fast RT predspremnik za prethodno miješanje (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG mješavina | 1 μL | 2 μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1 μL | 2 μL | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Do 25μL | Do 50μL | – |
1) a. Konačna koncentracija primera obično je 0,2 μM.Za bolje rezultate, koncentracija primera može se optimizirati unutar raspona od 0,2-1 μM.Općenito, koncentracija sonde može se optimizirati unutar raspona od 0,1-0,3 μM.
2) b. Pri korištenju brzog PCR postupka, povećanje koncentracije početnica i sondi može rezultirati boljim rezultatima umnožavanja, te bi njihov omjer trebao biti optimiziran u skladu s tim.
3) Različite vrste uzoraka sadrže različite vrste i sadržaj inhibitora i broj kopija ciljnog gena.Volumen uzorka treba uzeti u obzir prema stvarnom stanju.Po potrebi razrijedite uzorak vodom bez nukleaza ili TE puferom.
Reakcija Cuvjetima
| Redovni PCR postupak | Brzi PCR postupak | ||||||
| Postupak | Temp. | Vrijeme | Ciklus | Postupak | Temp. | Vrijeme | Ciklus |
| Obrnuta transkripcija | 50 ℃ | 10-20 minuta | 1 | Obrnuta transkripcija | 50 ℃ | 5 minuta | 1 |
| polimeraza Aktivacija | 95 ℃ | 1-5 minuta | 1 | polimeraza Aktivacija | 95 ℃ | 30-te godine | 1 |
| Denaturacija | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 (prikaz, stručni). | Denaturacija | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 (prikaz, stručni). |
| Žarenje i Proširenje | 56-64 ℃ | 20-60-ih godina | Žarenje i Proširenje | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kontrola kvalitete
1.Detekcija funkcije: osjetljivost, specifičnost i ponovljivost qPCR-a.
2.Nema aktivnosti egzogene nukleaze: nema egzogene endonukleaze i zagađenja egzonukleazom.
Bilješke
1.Brzina amplifikacije brze DNA polimeraze nije manja od 1kb/10s.Različiti PCR instrumenti imaju različite brzine zagrijavanja i hlađenja, načine kontrole temperature i toplinsku vodljivost, pa je stoga neophodna optimizacija vaše koncentracije primera/sonde i metode rada u kombinaciji s vašim specifičnim brzim PCR instrumentom.
2.Ovaj proizvod ima široku primjenjivost i pogodan je za visokoosjetljivu molekularnu dijagnostiku.Metoda PCR u tri koraka preporučuje se za primere s niskom temperaturom žarenja ili za umnožavanje dugih fragmenata preko 200 bp.
3.Budući da različiti amplikoni imaju različitu učinkovitost iskorištavanja dUTP-a i različitu osjetljivost na UNG, reagense treba optimizirati ako se osjetljivost detekcije smanji pri korištenju UNG sustava.Kontaktirajte nas za tehničku podršku ako je potrebna.
4.Kako bi se izbjeglo umnažanje produkata prijenosa PCR-a, za umnožavanje su potrebni namjenski eksperimentalni prostor i pipeta.Radite s rukavicama i često ih mijenjajte te nemojte otvarati PCR epruvetu nakon umnožavanja.
